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Purification and biochemical/molecular characterisation of antimicrobial peptides produced by Saccharomyces cerevisiae and evaluation of their mode of action
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Abstract(s)
ABSTRACT: The antagonistic effect exerted by Saccharomyces cerevisiae against other microbial species during wine fermentations was recently ascribed to its capacity to secrete antimicrobial peptides (AMPs). The main goal of the present work was to purify, identify and characterize those AMPs. Firstly, the AMPs were purified by means of chromatographic techniques (size-exclusion and ion-exchange) and then characterized regarding their amino acid sequence, codifying genes and antimicrobial/biochemical properties. Analysis of the purified AMPs by mass spectrometry revealed that the natural biocide is mainly composed by two peptides (AMP1 and AMP2/3) derived from the isoenzymes of the glycolytic protein glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). The spectrum of action of the naturally-excreted AMPs, which we named saccharomycin, is wide and includes several wine-related non-Saccharomyces yeasts, such as Hanseniaspora guilliermondii, Torulaspora delbrueckii, Kluyveromyces marxianus, Lachancea thermotolerans and Dekkera bruxellensis, as well as bacteria such as Oenococcus oeni. The antimicrobial effect of saccharomycin is significantly higher than that of synthetic analogues (AMP1 and AMP2/3) and depends on their complementary action and relative proportion. The mode of action of the AMPs was evaluated against sensitive yeast cells. The AMPs induce cell membrane permeabilization, loss of pH homeostasis and increase/decrease of H+-influx/-efflux. They also induce cell molecular markers typical of death by apoptosis in H. guilliermondii. Our work also revealed the accumulation of these GAPDH-derived peptides on the surface of stationary-grown (48 h) cells of S. cerevisiae, which induce death of non-Saccharomyces yeasts (H. guilliermondii and L. thermotolerans) by direct cell-cell contact. Finally, S. cerevisiae strains over-expressing these AMPs prevented growth of D. bruxellensis in co-fermentations, decreasing the levels of sulphur dioxide needed to control wine spoilage. Thus, the potential of these AMPs to be used as biopreservative in wine seems promising.
RESUMO: O efeito antagónico de Saccharomyces cerevisiae contra outras espécies microbianas durante fermentações vínicas foi recentemente atribuído à sua capacidade de excretar péptidos antimicrobianos (PAMs). O principal objetivo do presente estudo foi purificar, identificar e caracterizar estes PAMs. Primeiramente, os PAMs foram purificados por técnicas cromatográficas (exclusão molecular e permuta iónica) e posteriormente caracterizados quanto à sua sequência de aminoácidos, aos genes que os codificam e às suas propriedades antimicrobianas/bioquímicas. Os PAMs purificados foram, em seguida, analisados por espectrometria de massa, revelando que o biocida natural é composto maioritariamente por dois PAMs (PAM1 e PAM2/3) originários das três isoenzimas da proteína glicolítica gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. O espectro de ação dos PAMs naturais, os quais designámos por saccharomycin, é amplo e inclui várias leveduras vínicas, tais como Hanseniaspora guilliermondii, Torulaspora delbrueckii, Kluyveromyces marxianus, Lachancea thermotolerans e Dekkera bruxellensis, assim como a bactéria vínica Oenococcus oeni. O efeito antimicrobiano de saccharomycin é bastante mais acentuado do que o efeito dos análogos quimicamente sintetizados (PAM1 e PAM2/3) e depende da sua ação complementar, assim como da sua proporção relativa. O modo de ação dos PAMs foi analisado em leveduras sensíveis, verificando-se que estes induzem permeabilização da membrana celular, perda da homeostase do pH e aumento/decréscimo do influxo/efluxo de H+. Verificou-se igualmente, que os PAMs induzem morte por apoptose em H. guilliermondii. Descobrimos, ainda, que estes PAMs se acumulam na superfície de células estacionárias (48 h) de S. cerevisiae, as quais são capazes de induzir a morte de leveduras não-Saccharomyces (H. guilliermondii e L. thermotolerans) por contacto celular direto. Por fim, uma estirpe laboratorial de S. cerevisiae foi manipulada geneticamente de forma a sobre-expressar cada um dos PAMs, verificando-se que as estirpes manipuladas apresentaram um elevado efeito antimicrobiano contra D. bruxellensis, o que permitiu reduzir os níveis de dióxido de enxofre normalmente aplicados em vinhos. Assim, a utilização destes PAMs como um bioconservante alternativo no vinho parece promissora.
RESUMO: O efeito antagónico de Saccharomyces cerevisiae contra outras espécies microbianas durante fermentações vínicas foi recentemente atribuído à sua capacidade de excretar péptidos antimicrobianos (PAMs). O principal objetivo do presente estudo foi purificar, identificar e caracterizar estes PAMs. Primeiramente, os PAMs foram purificados por técnicas cromatográficas (exclusão molecular e permuta iónica) e posteriormente caracterizados quanto à sua sequência de aminoácidos, aos genes que os codificam e às suas propriedades antimicrobianas/bioquímicas. Os PAMs purificados foram, em seguida, analisados por espectrometria de massa, revelando que o biocida natural é composto maioritariamente por dois PAMs (PAM1 e PAM2/3) originários das três isoenzimas da proteína glicolítica gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. O espectro de ação dos PAMs naturais, os quais designámos por saccharomycin, é amplo e inclui várias leveduras vínicas, tais como Hanseniaspora guilliermondii, Torulaspora delbrueckii, Kluyveromyces marxianus, Lachancea thermotolerans e Dekkera bruxellensis, assim como a bactéria vínica Oenococcus oeni. O efeito antimicrobiano de saccharomycin é bastante mais acentuado do que o efeito dos análogos quimicamente sintetizados (PAM1 e PAM2/3) e depende da sua ação complementar, assim como da sua proporção relativa. O modo de ação dos PAMs foi analisado em leveduras sensíveis, verificando-se que estes induzem permeabilização da membrana celular, perda da homeostase do pH e aumento/decréscimo do influxo/efluxo de H+. Verificou-se igualmente, que os PAMs induzem morte por apoptose em H. guilliermondii. Descobrimos, ainda, que estes PAMs se acumulam na superfície de células estacionárias (48 h) de S. cerevisiae, as quais são capazes de induzir a morte de leveduras não-Saccharomyces (H. guilliermondii e L. thermotolerans) por contacto celular direto. Por fim, uma estirpe laboratorial de S. cerevisiae foi manipulada geneticamente de forma a sobre-expressar cada um dos PAMs, verificando-se que as estirpes manipuladas apresentaram um elevado efeito antimicrobiano contra D. bruxellensis, o que permitiu reduzir os níveis de dióxido de enxofre normalmente aplicados em vinhos. Assim, a utilização destes PAMs como um bioconservante alternativo no vinho parece promissora.
Description
Tese apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Engenharia Alimentar
Keywords
Wine microbial Saccharomyces cerevisiae Antimicrobial peptides Yeasts
Citation
Branco, Patrícia Alexandra Batista - Purification and biochemical/molecular characterisation of antimicrobial peptides produced by Saccharomyces cerevisiae and evaluation of their mode of action. Lisboa: Universidade de Lisboa, Instituto Superior de Agronomia, 2018, 272 p.